โครงการวิจัย
ผลจากการเปลี่ยนแปลงภูมิอากาศอย่างฉับพลันต่อระบบภูมิคุ้มกันและการ ยอมรับเชื้อ A. veronii สายพันธุ์ต่อต้านยาปฏิชีวนะในปลานิล (Oreochromis niloticus)
Effect of Abrupt Climate Change on Immune System and Susceptibility to Antibiotic-Resistant A. veronii Infection in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus)
รายละเอียดโครงการ
| ปีงบประมาณ | 2561 |
| หน่วยงานเจ้าของโครงการ | |
| ลักษณะโครงการ | โครงการใหม่ |
| ประเภทโครงการ | โครงการย่อย |
| โครงการหลัก (Master Project) | อุบัติการณ์เชิงฤดูกาลของโรค Motile Aeromonas Septicaemia (MAS) และการพัฒนานวัตกรรมเพื่อการควบคุมเชื้อ Aeromonas spp. ต่อต้านยาปฏิชีวนะกลุ่ม Tetracycline ในการเลี้ยงปลานิล (Oreochromis niloticus) ทางภาคใต้ของไทย |
| ประเภทงานวิจัย | |
| วันที่เริ่มโครงการวิจัย (พ.ศ.) | 1 มกราคม 2560 |
| วันที่สิ้นสุดโครงการวิจัย (พ.ศ.) | 1 มกราคม 2562 |
| วันที่ได้รับทุนวิจัย (พ.ศ.) | 1 มกราคม 2560 |
| ประเภททุนวิจัย | งบประมาณแผ่นดิน |
| สถานะโครงการ | สิ้นสุดโครงการ(ส่งผลผลิตเรียบร้อยแล้ว) |
| เลขที่สัญญา | |
| เป็นโครงการวิจัยที่ใช้ในการจบการศึกษา | ไม่ใช่ |
| เป็นโครงการวิจัยรับใช้สังคม | ไม่ใช่ |
| บทคัดย่อโครงการ | ผลจากการเปลี่ยนแปลงภูมิอากาศอย่างฉับพลันต่อระบบภูมิคุ้มกันและการยอมรับเชื้อ A. veronii สายพันธุ์ต่อต้านยาปฏิชีวนะในปลานิล (Oreochromis niloticus) Effect of Abrupt Climate Change on Immune System and Susceptibility to Antibiotic-Resistant A. veronii Infection in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) ลักษณะโครงการ (กรุณาทำเครื่องหมาย √ ในช่อง ) ชุดโครงการ โครงการย่อยภายใต้ชุดโครงการ อุบัติการณ์เชิงฤดูกาลของโรค Motile Aeromonas Septicaemia (MAS) และการพัฒนานวัตกรรมเพื่อการควบคุมเชื้อ Aeromonas spp. ต่อต้านยาปฏิชีวนะกลุ่ม Tetracycline ในการเลี้ยงปลานิล (Oreochromis niloticus) ทางภาคใต้ของไทย Seasonal Occurrence of Motile Aeromonas Septicaemia (MAS) and Innovation Development as Control Tool against Tetracycline-Resistant Aeromonas spp. in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Cultured in Southern Thailand โครงการเดี่ยว 2. วัตถุประสงค์โครงการ 2.1 เพื่อศึกษาผลของการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิอย่างรวดเร็วต่อระบบภูมิคุ้มกันในปลานิล 2.2 เพื่อศึกษาผลของการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิอย่างรวดเร็วต่อการยอมรับเชื้อ A. veronii และการแสดงออกของยีนความรุนแรงของเชื้อแบคทีเรีย 3. ขอบเขตการวิจัย งานวิจัยนี้แบ่งการศึกษาออกเป็น 2 ช่วงการศึกษา ได้แก่ การศึกษาในปีที่ 1 จะเน้นการศึกษาผลของการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิอย่างรวดเร็วต่อระบบภูมิคุ้มกันในปลานิล ศึกษาการแสดงออกของยีนในรูปแบบการวิเคราะห์เชิงปริมาณ (Real-time PCR analysis) รวมถึงการศึกษาผลของการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ ซึ่งเป็นปัจจัยความเครียดประการหนึ่งต่อกาทำงานของระบบภูมิคุ้มกันของปลานิล ทั้งในรูปแบบของการตอบสนองของเซลล์และระบบสารน้ำ การศึกษาปีที่ 2 จะเน้นศึกษาผลของการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิอย่างรวดเร็วต่อการยอมรับเชื้อ A. veronii ในปลานิลรวมถึงการแสดงออกของยีนความรุนแรงที่สำคัญของเชื้อแบคทีเรีย A. veronii โดยการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิจะยึดช่วงการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิจริงในสภาวะแวดล้อมของภาคใต้ ในรูปแบบที่มีแดดจัดและเปลี่ยนเข้าสู่สภาวะฝนตกหนัก ซึ่งจากการติดตามเบื้องต้นพบว่ามีความต่างของอุณหภูมิสูงถึง 10oC 4. ผลที่คาดว่าจะได้รับ 4.1 พัฒนาองค์ความรู้ใหม่ในการเข้าใจและจัดการโรค MAS จากเชื้อแบคทีเรียก่อโรคที่มีการระบาดพื้นภาคใต้ของไทย 4.2 ลดการสูญเสียและเพิ่มรายได้ในการเลี้ยงปลานิลให้แก่เกษตรกร 4.3 ผลงานวิจัยสามารถตีพิมพ์ในวารสารทางวิชาการระดับชาติไม่น้อยกว่า 1 เรื่อง โดยจัดอยู่ใน TCI กลุ่ม 1 เป็นองค์ความรู้ในการวิจัยต่อไปในด้านการพัฒนาศักยภาพและเพิ่มขีดความสามารถในการผลิตทางการเกษตรของประเทศไทย กลุ่มเป้าหมาย 1. นักวิชาการในสาขาจุลชีววิทยา เทคโนโลยีชีวภาพและการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ 2. บุคคลากรในอุตสาหกรรมการผลิต 5. วิธีการดำเนินการวิจัยและสถานที่ทำการทดลอง แนวทางการดำเนินการวิจัย การศึกษาปีที่ 1 ในปีที่ 1 (ปีงบประมาณ 2561) จะเป็นการเก็บข้อมูลอุณหภูมิและศึกษาผลของการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิต่อเชื้อแบคทีเรียก่อโรค A. veronii สายพันธุ์ต่อต้านยาปฏิชีวนะ และผลต่อระบบภูมิคุ้มกันในปลานิล 1) เก็บข้อมูลอุณหภูมิในบ่อเลี้ยงปลา สาขาประมง คณะเกษตรศาสตร์ อ.ทุ่งสง จ.นครศรีธรรมราช และบ่อเลี้ยงปลาของเกษตรกรในพื้นที่ อ.เมือง จ.นครศรีธรรมราช 2) ศึกษาผลของการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิต่อการเจริญเติบโตของเชื้อ A. veronii สายพันธุ์ต่อต้านยาปฏิชีวนะ โดยใช้รูปแบบอุณหภูมิที่ได้ข้อมูลเบื้องต้นจากข้อ 1) และเลี้ยงด้วยเครื่องเขย่าควบคุมอุณหภูมิที่อ่านค่าการดูดกลืนแสงแปลเป็นการเจริญเติบโตของเชื้อได้อย่างเป็นปัจจุบัน (real-time record) รวมถึงจะศึกษาการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงของเชื้อแบคทีเรียนี้เมื่ออยู่ในสภาวะอุณหภูมิที่เปลี่ยนแปลง 3) ศึกษาการการแสดงออกของยีนในระบบภูมิคุ้มกันของปลานิลภายใต้สภาวะเครียดจากการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิอย่างฉับพลันจากข้อมูลในข้อ 1) ออกแบบการทดลองแบบ CRD ประกอบด้วย 4 treatment 4 ซ้ำ ดังนี้ Treatment ที่ 1 ปลานิลที่ถูกเลี้ยงภายใต้สภาวะอุณหภูมิน้ำจากสภาวะอากาศปกติเฉลี่ยตลอดวัน (28±2 OC) Treatment ที่ 2 ปลานิลที่ถูกเลี้ยงภายใต้สภาวะอุณหภูมิน้ำขณะฝนตกหรืออุณหภูมิต่ำ (23 oC) Treatment ที่ 3 ปลานิลที่ถูกเลี้ยงภายใต้สภาวะอุณหภูมิน้ำขณะแดดจัดหรืออุณหภูมิสูง (33 oC) Treatment ที่ 4 ปลานิลที่ถูกเลี้ยงภายใต้สภาวะอุณหภูมิน้ำขณะแดดจัดสลับกับฝนตกหรืออุณหภูมิผันแปร (23-33 oC) โดยศึกษาทำการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนเป้าหมายในปลานิลด้วยเทคนิค qPCR และวิเคราะห์องค์ประกอบของเลือด ได้แก่ ฮีโมโกลบิน (Haemoglobin), ฮีมาโตคริต (Haematocrit), ปริมาณเม็ดเลือดแดงและเม็ดเลือดขาว (Red and white blood cell count), โปรตีนในพลาสมา (Plasma protein), กิจกรรมของเอนไซม์ไลโซไซม์ (Lysozyme activity) รวมถึงวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกัน ได้แก่ lysozyme g, IL-1β และ heat shock protein 70 โดยใช้ยีน β-actin (ซึ่งเป็น housekeeping gene) เป็นยีนอ้างอิงในการเปรียบเทียบ (reference gene) การศึกษาปีที่ 2 การศึกษาปีที่ 2 หรือปีงบประมาณ 2562 ศึกษาผลของการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิอย่างรวดเร็วต่อการยอมรับเชื้อ A. veronii ในปลานิลรวมถึงการแสดงออกของยีนความรุนแรงที่สำคัญของเชื้อแบคทีเรีย A. veronii 1) ศึกษาการแสดงออกของยีนแสดงความรุนแรงควบคู่กับการเจริญเติบโตของเชื้อ A. veronii ในห้องปฏิบัติการ โดยเลี้ยงเชื้อแบคทีเรีย A. veronii จำนวน 3 ไอโซเลท ได้แก่ AV-1, AV-8 และ AV-28 ซึ่งเป็นเชื้อ A. veronii ที่ต่อต้านยาปฏิชีวนะกลุ่ม tetracycline มากกว่า 1 ชนิด ซึ่งอุณหภูมิที่กำหนดมีจำนวน 2 รูปแบบ ได้แก่ รูปแบบที่ 1 อุณหภูมิน้ำระหว่าง 24–30oC (ช่วงอุณหภูมิปกติ) รูปแบบที่ 2 อุณหภูมิน้ำระหว่าง 22–30oC (ช่วงอุณหภูมิผันแปร ร้อนและมีฝน) เลี้ยงเชื้อ A. veronii ในเครื่องเขย่าควบคุมอุณหภูมิที่อ่านค่าการดูดกลืนแสงแปลเป็นการเจริญเติบโตของเชื้อได้อย่างเป็นปัจจุบัน (real-time record) ในรูปแบบอุณภูมิข้างต้นเป็นเวลา 24 ชั่วโมง แล้วเก็บเซลล์แบคทีเรีย เพื่อสกัด RNA แล้วศึกษาการแสดงออกของยีนความรุนแรงด้วยเทคนิค semi-quantitative RT-PCR โดยยีนความรุนแรงที่ศึกษามีจำนวน 5 ยีน ได้แก่ Lipase, Elastase, Enolase, Aerolysin และ Enterotoxin และใช้ 16S rDNA เป็น reference gene 2) ศึกษาผลของการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิอย่างรวดเร็วต่อภูมิคุ้มกันและการยอมรับเชื้อ A. veronii ในปลานิล ออกแบบการทดลองแบบ CRD ประกอบด้วย 4 treatment 3 ซ้ำ ดังนี้ Treatment ที่ 1 ปลานิลที่ถูกเลี้ยงภายใต้สภาวะอุณหภูมิปกติ (28±2 OC) และไม่ได้รับเชื้อ A. veronii Treatment ที่ 2 ปลานิลที่ถูกเลี้ยงภายใต้สภาวะอุณหภูมิปกติ (28±2 OC) และได้รับเชื้อ A. veronii (WT) 0.1 ml ต่อตัว (106 CFU/ml) Treatment ที่ 3 ปลานิลที่ถูกเลี้ยงภายใต้สภาวะอุณหภูมิผันแปร (22–30oC) และไม่ได้รับเชื้อ A. veronii Treatment ที่ 4 ปลานิลที่ถูกเลี้ยงภายใต้สภาวะอุณหภูมิผันแปร (22–30oC) และได้รับเชื้อ A. veronii (MAR) 0.1 ml ต่อตัว (106 CFU/ml) โดยชุดการทดลองแต่ละชุด จะเลี้ยงปลานิลขนาด 30±5 g จำนวน 14 ตัว/บ่อพลาสติกขนาด 200 l บรรจุน้ำ 150 l ซึ่งควบคุมคุณภาพน้ำตามระเบียบการเลี้ยงสัตว์ทดลองที่มีคุณธรรม โดยทำการปรับสภาพของปลา 1 อาทิตย์หลังจากย้ายเลี้ยง (ภายใต้การควบคุมอุณหภูมิที่ (28±2 OC) เมื่อเริ่มการทดลองปลานิลจะถูกเลี้ยงภายใต้สภาวะที่กำหนด โดยปลา 2 ตัวจากแต่ละบ่อจะถูกเก็บเนื้อเยื่อที่มีการแสดงออกของยีนเป้าหมายและรวมเป็นตัวอย่างเดียว โดยทำการเก็บตัวอย่างที่เวลา 0, 12 ชั่วโมง1, 3, 5 วันหลังจากเริ่มต้นทดลอง ทำการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนเป้าหมายทั้งในปลานิลด้วยเทคนิค qPCR ตามวิธีการที่ได้จากการวิจัยขั้นต้น 6. แผนการดำเนินงานโครงการ ระยะเวลาการดำเนินงาน 2 ปี 0 เดือน (ปีงบประมาณ 2561 และ 2562) การดำเนินงาน เดือนที่ 3 6 9 12 15 18 21 24 1. วางแผน เตรียมอุปกรณ์ 2. การเตรียมอุปกรณ์ ทดสอบวิธีการในการศึกษาการแสดงออกของยีนในระบบภูมิคุ้มกันของปลานิล รวมถึงการเจริญเติบโตของเชื้อ A. veronii ภายใต้สภาวะเครียดจากการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิอย่างฉับพลัน 3. ดำเนินการทดลอง 4. การวิเคราะห์องค์ประกอบเลือด 5. การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกัน 6. การเตรียมอุปกรณ์ ทดสอบวิธีการในการการศึกษาการแสดงออกของยีนความรุนแรงของเชื้อ A. veronii ด้วยเทคนิค semi-quantitative RT-PCR 7. การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรง 8. การศึกษาผลของการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิอย่างรวดเร็วต่อภูมิคุ้มกันและการยอมรับเชื้อ A. veronii ในปลานิล 9. อบรมถ่ายทอดเทคโนโลยี 10. สรุปรายงานการวิจัย 7. ผลการดำเนินงาน ความก้าวหน้าของการดำเนินการโดยสรุป การทดลองที่ 1 ผลของการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิต่อระบบภูมิคุ้มกันของปลานิล จากผลการดำเนินงานเลี้ยงปลานิลที่อุณหภูมิต่างกันพบว่ามีผลต่อค่า blood parameters แต่ที่สำคัญ คือ อุณหภูมิที่เปลี่ยนแปลงไป ส่งผลต่อระบบภูมิคุ้มกันของปลานิลอย่างชัดเจน โดยสรุปจากระดับการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกันของปลานิล ได้แก่ ยีน lysozyme, IL-1B และ heat-shock protein 70 ซึ่งอุณหภูมิแบบผันแปรส่งผลให้มีการแสดงออกของยีนภูมิคุ้มกันที่ลดลง (down regulation) ได้แก่ ยีน lysozyme และ IL-1B เมื่อเทียบกับปลาที่เลี้ยงในอุณหภูมิปกติ แต่ในทางตรงกันข้ามยีน heat-shock protein 70 เพิ่มสูงขึ้นอย่างชัดเจนในปลาที่เลี้ยงด้วยอุณหภูมิแบบผันแปร (รูปที่ 1) รูปทื่ 1 การแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกันของปลานิลที่เลี้ยงภายใต้อุณหภูมิต่างกัน (A) Lysozyme (B) IL-1β และ (C) Heat shock protein 70 การทดลองที่ 2 การศึกษาผลของการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิต่อการแสดงออกของยีนแสดงความรุนแรงควบคู่กับการเจริญเติบโตของเชื้อ A. veronii ในห้องปฏิบัติการ ในการศึกษาที่ 2 ทำการศึกษาในระดับห้องปฏิบัติการโดยใช้เชื้อ A. veronii จำนวน 3 ไอโซเลทเป็นโมเดล แล้วทำการเลี้ยงภายใต้อุณหภูมิที่แตกต่างกัน 2 รูปแบบ ได้แก่ อุณหภูมิปกติ และ อุณหภูมิผันแปร ผลการศึกษาพบว่า รูปแบบอุณหภูมิที่แตกต่างกัน ส่งผลให้การเจริญเติบโตและการแสดงออกของยีนความรุนแรงในเชื้อ A. veronii แตกต่างกัน โดยพบว่ารูปแบบอุณหภูมิผันแปรจะทำให้การเจริญเติบโตของเชื้อแบคทีเรียเพิ่มสูงกว่าอุณหภูมิปกติ สังเกตได้จากกราฟการเจริญเติบโต (growth curve) ในรูปที่ 2 อย่างไรก็ตามเมื่อพิจารณาความสัมพันธ์เชื่อมโยงระหว่างรูปแบบอุณหภูมิที่เปลี่ยนแปลงไปกับการแสดงออกของยีนความรุนแรง พบว่าไม่สามารถหาข้อสรุปได้ แต่โดยส่วนใหญ่อุณหภูมิปกติจะทำให้ระดับการแสดงออกของยีนความรุนแรงสูงกว่าอุณหภูมิปกติ ดังแสดงในรูปที่ 3 รูปที่ 2 กราฟการเจริญเติบโต (growth curve) ของเชื้อ A. veronii ที่เลี้ยงภายใต้รูปแบบอุณหภูมิต่างกัน คือ อุณหภูมิปกติ และอุณหภูมิผันแปรในช่วงร้อนและมีฝน การทดลองที่ 3 ผลของการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิอย่างรวดเร็วต่อภูมิคุ้มกันและการยอมรับเชื้อ A. veronii ในปลานิล อยู่ในระหว่างการเตรียมปลาทดลองให้ได้ขนาด 30±5 g รุนแรง รูปที่ 3 การแสดงออกของยีนความรุนแรงของเชื้อ A. veronii ที่เลี้ยงภายใต้รูปแบบอุณหภูมิต่างกัน คือ อุณหภูมิปกติ และอุณหภูมิผันแปรในช่วงร้อนและมีฝน 6. ปัญหา/อุปสรรค ไม่มี 7. ความต้องการสนับสนุนจากมหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลศรีวิชัยเพื่อให้การดำเนินงานเป็นไปตามแผน ไม่มี |
| รายละเอียดการนำไปใช้งาน | |
| เอกสาร Final Paper(s) |
|
ทีมวิจัย
หัวหน้าโครงการ
| ที่ | นักวิจัย | หน่วยงาน | ตำแหน่งในทีม | การมีส่วนร่วม (%) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | มณี ศรีชะนันท์ | คณะเกษตรศาสตร์ ราชมงคลศรีวิชัย วิทยาเขตนครศรีธรรมราช | หัวหน้าโครงการ | 50 |
| 2 | ดร. กิตติชนม์ อุเทนะพันธุ์ | คณะเกษตรศาสตร์ ราชมงคลศรีวิชัย วิทยาเขตนครศรีธรรมราช | ผู้ร่วมวิจัย | 20 |
| 3 | นิอร จิรพงศธรกุล | คณะเกษตรศาสตร์ ราชมงคลศรีวิชัย วิทยาเขตนครศรีธรรมราช | ผู้ร่วมวิจัย | 30 |