โครงการวิจัย

          1.1 ขั้นตอนการเตรียมน้ำกะทิ โดยนำเนื้อมะพร้าวขูดสดและคั้นกะทิโดยใช้สัดส่วนน้ำต่อเนื้อมะพร้าวขูดสดในอัตราส่วน 1 ต่อ 1 โดยน้ำหนัก (ใช้น้ำต้มสุกและตั้งทิ้งไว้ให้เย็นที่อุณหภูมิห้อง)

          1.2 ขั้นตอนการเตรียมสารละลายจากพรมมิและใบบัวบก

หาอัตราส่วนที่เหมาะสม ของอัตราส่วนของเนื้อมะพร้าว: ใบบัวบก หรือใบพรมมิ ดังนี้  5 kg : 200 g,  5 kg : 400 g, 5 kg : 600 g, 5 kg : 800 g, 5 kg : 1000 g  โดยนำมาล้างให้สะอาด จากนั้นปั่นพร้อมแยกกาก และเอาเฉพาะส่วนที่เป็นสารละลาย นำส่วนผสมน้ำกะทิสดและสารละลายจากสมุนไพรพรมมิ และใบบัวบก จากนั้นตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิ -4 องศาเซลเซียส จนกระทั่งเห็นชั้นครีมแยกตัวออกมาจากชั้นน้ำ จากนั้นนำส่วนที่เป็นชั้นครีมหลอมให้ละลายเพื่อจะนำไปปั่นเหวี่ยงที่ความเร็วรอบ 4,500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 3 นาที สังเกตเห็นน้ำมันจะแยกออกจากชั้นครีม นำน้ำมันที่ได้กรองโดยให้เครื่องกรองสุญญากาศและเก็บในขวดแก้วชา ซึ่งจะได้สารสกัดจากพรมมิและใบบัวบกในน้ำมันมะพร้าวด้วยเทคนิคการสกัดเย็น  

2. วิเคราะห์หาปริมาณสารสำคัญจากสารสกัดพรมมิและใบบัวบกในน้ำมันมะพร้าว

          2.1 วิเคราะห์หาปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด

                   2.2 วิเคราะห์ปริมาณสารสำคัญ จากสารสกัดพรมมิและใบบัวบก ผสมน้ำมันมะพร้าว โดยใช้เทคนิค (Gas Chromatography-Mass Spectrometry; GC-MS)

          3. การศึกษาประสิทธิภาพของสารสกัดจากพรมมิและใบบัวบก ผสมน้ำมันมะพร้าวต่อการบำรุงสมองและป้องกันอัลไซเมอร์ ด้วยวิธีการศึกษาการยับยั้งเอนไซม์อะซีทิลโคลีนเอสเทอเรส Acethylcholinesterase (Ache)

การยับยั้งเอนไซม์อะซีทิลโคลีนเอสเทอเรส ถูกวิเคราะห์และติดตามผลด้วยวิธีทางสเปกโตรโฟโตเมตรี โดยใช้อะซีทิลไธโอโคลีน ไอโอไดด์ เป็นสารตั้งต้น โดยวิธีดังกล่าวเป็นวิธีที่ปรับปรุงมาจากวิธีการของ Ellman (Ellman et. al., 1961) การทดลองจะใช้ถาดหลุมชนิด 96 หลุม โดยเริ่มแรกใส่ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ pH 8.0 ปริมาตร 140 มิลลิลิตร ตามด้วย 20 มิลลิลิตรของสารละลายเอนไซม์ โคลีนเอสเทอเรส (0.2 U/mL) และ 20 มิลลิลิตรของสารตัวอย่างที่ละลายใน 80% เมทานอล จากนั้นบ่ม สารผสมดังกล่าวเป็นเวลา 15 นาที สุดท้ายเติม 20 มิลลิลิตรของสารละลายผสม 5 มิลลิโมลาร์สารละลาย 5,5′-ไดไธโอบิช[2-ไนโตรเบนโซอิค แอซิด] ที่มีโปรตีนมาตรฐาน bovine serum albumin (BSA) อยู่ 0.1% และ 5 มิลลิโมลาร์สารละลายอะซีทิลไธโอโคลีน ไอโอไดด์ ในอัตราส่วน 5 ต่อ 1 นำไปเขย่าที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 2 นาที และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 405 นาโนเมตร ด้วยเครื่อง Microtiter plate reader

          4. ศึกษาคุณภาพของผลิตภัณฑ์เสริมอาหารจากสารสกัดพรมมิและใบบัวบกในน้ำมันมะพร้าวบรรจุแคปซูลนิ่ม  ตามมาตรฐาน อ.ย.

          4.1 การศึกษาคุณภาพของผลิตภัณฑ์เสริมอาหารจากสารสกัดพรมมิและใบบัวบกในน้ำมันมะพร้าวสารสกัดพรมมิและใบบัวบกในน้ำมันมะพร้าว เพื่อให้เป็นไปตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข (ฉบับที่ 293) พ.ศ. 2548  นำน้ำมันมะพร้าวที่มีสารสกัดจากขมิ้นมาทำการวิเคราะห์คุณภาพทางเคมี และคุณภาพทางจุลินทรีย์ ดังนี้

                   4.1.1 คุณภาพหรือมาตรฐานทางเคมี

                   ทดสอบ  Heavy metals and Pesticides ตามวิธีของ (AOAC)

    -Cd

                                      -Cu

                                      -Fe

                                      -Hg

                                      -Pb

                                      -As

                                      -DDT

                                      -PCB

                                      -Lindane

                   ตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข (ฉบับที่ 293) พ.ศ. 2548 เรื่องผลิตภัณฑ์เสริมอาหาร กำหนดให้ผลิตภัณฑ์เสริมอาหารตรวจพบ ตะกั่วและสารหนูทั้งหมดดังนี้

                   ตะกั่ว (Lead)                                                    ไม่เกิน 1  มก./กก.

                   สารหนูทั้งหมด (Total Arsenic)                                ไม่เกิน 2  มก./กก.

                   4.1.2 คุณภาพหรือมาตรฐานจุลินทรีย์

                             ตรวจวิเคราะห์หาจุลินทรีย์ต่อไปนี้ตามวิธีของ (BAM 2001)

          - สแตฟฟิโลคอคคัส ออเรียส (Staphylococusoureus)       ตรวจไม่พบต่ออาหาร 0.1 กรัม

          - คลอสทริเดียม (Clostridium spp.)                           ตรวจไม่พบต่ออาหาร 0.1 กรัม

          - ซัลโมเนลลา (Samonella spp.)                              ตรวจไม่พบต่ออาหาร 25 กรัม

          - แบคทีเรียชนิด อี.โคไล (Escherichia coli)  น้อยกว่า 3 ต่ออาหาร 1 กรัม โดยวิธี เอ็มพีเอ็น

          ตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข (ฉบับที่ 293) พ.ศ. 2548 เรื่องผลิตภัณฑ์เสริมอาหาร กำหนดให้ผลิตภัณฑ์เสริมอาหารตรวจพบไม่พบจุลินทรีย์ในผลิตภัณฑ์ดังนี้

          - สแตฟฟิโลคอคคัส ออเรียส (Staphylococusoureus)       ตรวจไม่พบต่ออาหาร 0.1 กรัม

          - คลอสทริเดียม (Clostridium spp.)                           ตรวจไม่พบต่ออาหาร 0.1 กรัม

          - ซัลโมเนลลา (Samonella spp.)                               ตรวจไม่พบต่ออาหาร 25 กรัม

          - แบคทีเรียชนิด อี.โคไล (Escherichia coli) น้อยกว่า 3 ต่ออาหาร 1 กรัม โดยวิธี เอ็มพีเอ็น

          5. ศึกษาความคงตัวของผลิตภัณฑ์อาหารเสริมบรรจุแคปซูลระหว่างการเก็บรักษา

          นำสารสกัดพรมมิและใบบัวบกในน้ำมันมะพร้าวสารสกัดพรมมิและใบบัวบกในน้ำมันมะพร้าวบรรจุแคปซูลเจลาตินปริมาณ 500 มิลลิกรัมต่อแคปซูล และขวดสีชาจำนวน 100 แคปซูลต่อขวด ใส่สารดูดความชี้นขวดละ 1 ซอง จากนั้นนำไปเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ 40oC จากนั้นสุ่มแคปซูลขวดละ 3 ตัวอย่าง เป็นระยะเวลา 3 เดือน สุ่มตรวจสอบคุณภาพดังนี้ วิเคราะห์หาปริมาณสาระสำคัญ ทดสอบคุณภาพทางเคมี คุณภาพทางจุลินทรีย์ และคุณภาพทางประสาทสัมผัส ทุกๆ  สัปดาห์

                    1. ทดสอบคุณภาพทางเคมี

                             - วิเคราะห์ค่าเปอร์ออกไซด์ 

                             - กรดไขมันอิสระ 

                   2. คุณภาพทางจุลินทรีย์

                             จำนวนจุลินทรีย์ทั้งหมดจากวิธีของ (BAM 2001)

6. ศึกษาวิจัยทางคลินิกระยะที่ 1 การประเมินความปลอดภัยในอาสาสมัครสุขภาพดีของการสกัดสารจากใบดอกดาวเรืองในน้ำมันมะพร้าว

โดยการรับประทานผลิตภัณฑ์เสริมอาหารจากสารสกัดพรมมิและใบบัวบกในน้ำมันมะพร้าวบรรจุแคปซูลนิ่ม ครั้งละ 500 มิลลิกรัม วันละ 1. ครั้ง เป็นระยะเวลา 28 วัน และติดตามความปลอดภัยหลังรับประทานยาอีก 7 วัน (รวมทั้งสิ้น 35 วัน) โดยจะนัดหมายอาสาสมัครสุขภาพดี อายุระหว่าง 18 – 60 ปี จำนวน 36 คน มาพบผู้วิจัยรวมทั้งสิ้น 5 ครั้ง (คัดกรอง 1 ครั้ง และนัดหมายเจาะเลือด 4 ครั้ง ในวันที่ 0, 14, 28 และ 35) เพื่อดูความปลอดภัยของผลิตภัณฑ์เสริมอาหารจากสารสกัดพรมมิและใบบัวบกในน้ำมันมะพร้าวบรรจุแคปซูลนิ่ม

การคำนวณขนาดตัวอย่าง

การศึกษาวิจัยในอาสาสมัครสุขภาพดีครั้งนี้ ใช้อาสาสมัครอย่างน้อย 30 คน จึงจะสามารถแปลผลความปลอดภัยได้ และเนื่องจากในระหว่างการศึกษาวิจัยอาจมีอาสาสมัครถอนตัว, ยุติ หรือหายไปจากการเข้าร่วมเป็นอาสาสมัคร จึงได้ทำการกำหนดอัตราการถอนตัว, ยุติ หรือหายไปจากการเข้าร่วมเป็นอาสาสมัคร (Dropout rate) ไว้ 20% จึงได้ขนาดตัวอย่างของอาสาสมัครในการวิจัยครั้งนี้ จำนวนทั้งสิ้น 36 คน

เกณฑ์การคัดเลือกอาสาสมัคร (Inclusion criteria)

1) อาสาสมัครสุขภาพดีทั้งเพศชายและเพศหญิง ที่มีอายุระหว่าง 18-60 ปี

2) ยินดีให้ความร่วมมือในการปฏิบัติตามแนวทางการวิจัย และสามารถมาตามนัดหมายได้ตลอดช่วงของการศึกษาวิจัย

3) มีค่า BMI ไม่เกินมาตรฐาน

4) ผลการตรวจในห้องปฏิบัติการ (ผลเลือด) อยู่ในเกณฑ์ปกติ

5) สมัครใจเข้าร่วมโครงการวิจัย หลังจากได้รับฟังคำอธิบายถึงกระบวนการวิจัยอย่างชัดเจน และยินดีที่จะลงนามด้วยตนเองในเอกสารแสดงความยินยอมเข้าร่วมโครงการวิจัย (Consent form) และไม่อยู่ในระหว่างการเข้าร่วมโครงการวิจัยอื่น

เกณฑ์การคัดออกผู้ร่วมวิจัย/อาสาสมัคร (Exclusion criteria)

1) มีประวัติแพ้สารสกัดพรมมิ บัวบก น้ำมันมะพร้าว หรือผลิตภัณฑ์เสริมอาหารจากสารสกัดพรมมิและใบบัวบกในน้ำมันมะพร้าวบรรจุแคปซูลนิ่ม

2) หญิงตั้งครรภ์, อยู่ในระหว่างการให้นมบุตร, วางแผนจะตั้งครรภ์

เกณฑ์การถอนผู้ร่วมวิจัย/อาสาสมัครหรือยุติการเข้าร่วมการวิจัย (Withdrawal or termination criteria)

1) บุคคลที่มีอาการไม่พึงประสงค์ที่รุนแรง ได้แก่ บวมรอบปากและเปลือกตาด้านบน คลื่นไส้ อาเจียน แน่นหน้าอก และหายใจลำบาก

2) บุคคลที่มีความประสงค์จะหยุดหรือออกจากการเป็นอาสาสมัครในช่วงการศึกษา2) บุคคลที่มีความประสงค์จะหยุดหรือออกจากการเป็นอาสาสมัครในช่วงการศึกษาวิจัย

เกณฑ์การยุติทั้งโครงการ (Stopping  rule)

อาสาสมัครปกติที่ได้รับสารทดสอบจากผลิตภัณฑ์เสริมอาหารจากสารสกัดพรมมิและใบบัวบกในน้ำมันมะพร้าวบรรจุแคปซูลนิ่ม เกิดอาการข้างเคียงรุนแรงหรือมีแนวโน้มถึงแก่ชีวิต จะยุติทั้งโครงการทันที

ประชากรเป้าหมาย (Target population)

อาสาสมัครปกติสุขภาพดี (Healthy volunteers)

การเลือกตัวอย่าง (Sampling method)           

อาสาสมัครสุขภาพดี ทั้งหมด 36 คน ซึ่งเป็นไปตามเกณฑ์การคัดเลือก (Inclusion criteria) และเกณฑ์การคัดออก (Exclusion criteria)

กระบวนการวิจัย (Research methodology

อาสาสมัครจะได้รับผลิตภัณฑ์เสริมอาหารจากสารสกัดพรมมิและใบบัวบกในน้ำมันมะพร้าวบรรจุแคปซูลนิ่มวันละ 500 มิลลิกรัม จำนวน 1 ครั้ง รับประทานก่อนอาหารเช้า เป็นระยะเวลา 28 วัน ในการวิจัยนี้ การซักประวัติ การตรวจร่างกาย และผลการตรวจทางห้องปฏิบัติการ (เม็ดเลือดแดงและเม็ดเลือดขาว ระดับน้ำตาลในเลือด ระดับไขมัน ค่าตับ ค่าไต ) จะถูกเก็บข้อมูลในวันคัดกรอง, วันเริ่มการวิจัย (วันที่ 0), วันที่ 14, วันที่ 28, และวันที่ 35 (หลังจากหยุดการรับประทานผลิตภัณฑ์ 1 สัปดาห์)

กระบวนการเก็บข้อมูล (data collection process

ทำการเก็บรวบรวมข้อมูลหลังจากได้รับการรับรองจากคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยในมนุษย์ มหาวิทยาลัยนเรศวรโดยการใช้แบบบันทึกผู้ป่วย (Case record form) โดยแบ่งออกเป็น 2 ส่วน คือ ส่วนที่ 1 แบบคัดกรอง และส่วนที่ 2 แบบติดตามอาการ โดยไม่ระบุชื่อ-นามสกุล, Hospital number (HN), ที่อยู่ เบอร์โทรศัพท์ หรือ Identification รูปแบบอื่นๆ ที่สามารถระบุผู้ร่วมวิจัย/อาสาสมัครได้เป็นรายบุคคล โดยให้ใช้เป็นรหัสแทน

การวัดผล (outcome measurement)

- ข้อมูลทั่วไปที่ได้จากการซักประวัติและตรวจร่างกายของอาสาสมัครทั้งหมดจากแบบคัดกรอง

- ข้อมูลที่ได้จากแบบติดตามอาการ ประกอบด้วย การวัดสัญญาณชีพ, อาการไม่พึงประสงค์ และผลจากห้องปฏิบัติการ  (เม็ดเลือดแดงและเม็ดเลือดขาว ระดับน้ำตาลในเลือด ระดับไขมัน ค่าตับ- ข้อมูลที่ได้จากแบบติดตามอาการ ประกอบด้วย การวัดสัญญาณชีพ, อาการไม่พึงประสงค์ และผลจากห้องปฏิบัติการ  (เม็ดเลือดแดงและเม็ดเลือดขาว ระดับน้ำตาลในเลือด ระดับไขมัน ค่าตับ ค่าไต

การวิเคราะห์ผลการวิจัย (outcome measurement / data analysis/statistical analysis)

กระบวนการวัดผล/วิเคราะห์เป็นการแสดงผลการซักประวัติ ตรวจร่างกาย ผลการตรวจทางห้องปฏิบัติการ และอาการไม่พึงประสงกระบวนการวัดผล/วิเคราะห์เป็นการแสดงผลการซักประวัติ ตรวจร่างกาย ผลการตรวจทางห้องปฏิบัติการ และอาการไม่พึงประสงค์